Glykolytische Oszillationen bei Hefezellextrakten

Vergleich von kalorimetrischen, photometrischen und biochemischen Untersuchungen mit energetischen Betrachtungen

Drong, Karin


Periodische Prozesse sind in biologischen Systemen weit verbreitet. Bei fast allen Lebewesen sind inzwischen Anpassungen nicht nur an die räumliche Umwelt, sondern auch an zeitliche Strukturen bekannt. So wurden auch bei der Glykolyse, die ja der zentrale und ubiquitäre Stoffwechselweg zum Abbau von Kohlenhydraten in allen Organismen ist, oszillierende Schwankungen der Konzentrationen von NAD und NADH gefunden. Diese Oszillationen lassen sich an Hefezellextrakten, welche alle Metabolite der glykolytischen Kette enthalten, untersuchen. Es wurden photometrische, potentiometrische und kalorimetrische (Messung des Wärmeflusses) Signale, z.T. simultan, unter dem Einfluß verschiedener Substratkonzentrationen, Stoffwechseleffektoren (DNP, KCN, NaF), bei verschiedenen Temperaturen sowie mit Zugabe des Enzyms Trehalase beobachtet.
Die Phasenlage zwischen den NAD-Konzentrationen und dem Wärmefluß, die Dynamik des Wärmeflusses sowie der Wärmegehalt und die Bestimmung der Reaktionsenthalpie der vollständigen Umwandlung der Glucose in Ethanol und Kohlendioxid werden hier untersucht und im Vergleich mit theoretischen Betrachtungen diskutiert.


Inhalt:

Symbole und Abkürzungen
  1. Einleitung
    1. Oszillationen bei der Glykolyse
    2. Überblick über den aktuellen Wissensstand
    3. Die Regulation des glykolytischen Oszillators
      1. Der PFK-Oszillator
      2. Der GAPDH-Oszillator
  2. Fragestellung dieser Arbeit
  3. Material und Methoden
    1. Chemikalien, enzymatische Tests und Versuchsansatz
    2. Untersuchungsobjekt
    3. Geräte
      1. Kalorimetrie
        1. Allgemeines
        2. Apparativer Aufbau des Kalorimeters
      2. Photometrie
      3. Simultane Kalorimetrie und Photometrie
      4. Potentiometrie
      5. Geräte zur Bestimmung des Gasstoffwechsels
      6. Kernresonanzspektroskopie (NMR)
  4. Meßwertverarbeitung
    1. Grundsätzliches
    2. Kalorimetrie
      1. Bestimmung der Zeitkonstanten
      2. Bestimmung der Apparatefunktion r(t)
      3. Die Entfaltung mit der Tian-Gleichung
      4. Die Fourier-Transformation
    3. Kernresonanzspektroskopie (NMR)
      1. Berechnung der Abtastzeit
      2. Eigentliche Messung
      3. Datenanalyse
  5. Energetische Betrachtungen der Glykolyse
    1. Grundlagen
    2. Berechnung der Freien Enthalpie der alkoholischen Gärung aus den Freien Enthalpien der einzelnen Reaktionen
    3. Berechnung der Enthalpie D H der alkoholischen Gärung aus den Bildungsenthalpien der Produkte und der Ausgangsstoffe der Summenreaktion
    4. Proportionalität zwischen glykolytischem Fluß und Wärmefluß
  6. Ergebnisse
    1. Optimierungsversuche bei der Extraktion
      1. Alternative Homogenisationsmethoden
      2. Variation der Homogenisationsdauer
      3. Einsatz unterschiedlicher Homogenisationspuffer
      4. Verwendung anderer Hefestämme
      5. Charakterisierung der verwendeten Extrakte
    2. Ergebnisse der NAD+/NADH-Messungen
      1. Einfluß des Rührens während der simultanen Messungen auf das optische Meßsignal
      2. Sonderformen der Oszillationen
    3. Ergebnisse der Kalorimetrie
      1. Effekte des Rührens auf das kalorimetrische Signal
      2. Einfluß der Temperatur auf das kalorimetrische Signal
        1. Bestimmung der Aktivierungsenergie Ea
        2. Bestimmung des Q10-Werts
      3. Auswirkungen der Stoffwechselinhibitoren NaF, KCN und DNP sowie einer reinen Stickstoff-Atmosphäre auf den Wärmefluß von oszillierenden Hefezellextrakten
      4. Bestimmung der Reaktionsenthalpie und des glykolytischen Flusses mit Hilfe der Kalorimetrie
      5. Intermittenzen des Wärmeflusses
      6. Flußkontrolle in glykolytischen Oszillationen von Hefezellextrakten durch Zugabe von Trehalase
        1. Einfluß der Trehalase auf die Anzahl der Schwingungen
        2. Einfluß der Trehalase auf den glykolytischen Fluß
    4. Ergebnisse simultaner Messungen von NAD>+-Konzentration, pH-Wert und Druck im Kalorimeter
      1. Vergleich der Phasenlage zwischen den Extrema in den Oszillationen der NAD+-Konzentration und des Wärmeflusses
      2. Vergleich der Phasenlage zwischen den Extrema in den Oszillationen des pH-Wertes und des Wärmeflusses
      3. Simultane Druckmessungen
    5. Biochemische Bestimmungen
    6. Gasstoffwechsel der Hefezellextrakte
      1. Kohlendioxid-Produktion
      2. Sauerstoff-Verbrauch
        1. Vergleich des Sauerstoff-Verbrauchs der Hefezellextrakte mit dem intakter Zellen
        2. Berechnung der Wärmetönung für den Sauerstoff-Verbrauch der Hefezellextrakte
    7. Ergebnisse der Kernresonanzspektroskopie
      1. Das 31P-Kernresonanzspektrum von Hefezellextrakten
      2. Das 1H-Kernresonanzspektrum von Hefezellextrakten
  7. Diskussion
    1. Ergebnisse aus der Kalorimetrie
      1. Bestimmung des glykolytischen Flusses J
      2. Auftreten von Intermittenzen im Wärmefluß
      3. Zur Flußkontrolle durch Trehalase-Gaben
      4. Zur möglichen Bedeutung einer geringen Reaktionsenthalpie
      5. Fehlen der Rühreffekte im kalorimetrischen Meßsignal
    2. Ergebnisse der biochemischen und manometrischen Bestimmungen
    3. Ergebnisse aus den Messungen zur Phasenlage
    4. Ergebnisse der Kernresonanzspektroskopie
    5. Mögliche Einflüsse der Essigsäure auf die Wärmetönung glykolytischer Hefezellextrakte
    6. Vergleich des glykolytischen Oszillators mit biologischen Uhren
  8. Ausblick
  9. Zusammenfassung
  10. Anhang A
    1. Kalibrierung des Triflux-012-Kalorimeters
      1. Grundsätzliches
      2. Die elektrische Kalibrierung
      3. Die chemische Kalibrierung
      4. Fazit
  11. Literatur
  12. Zitatnachweis
Danksagung




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