Calcium und GTP-bindende Proteine in der Regulation der Exocytose von Granulocyten

Nüße, Oliver


Die Exocytose ist ein weit verbreiteter Mechanismus zur gezielten Ausschleusung von Substanzen aus einer Zelle. Am Beispiel der neutrophilen Granulocyten untersucht der Autor die Regulationsmechanismen der Exocytose. Dabei wird die Patch-clamp-Technik eingesetzt, eine elektrophysiologische Methode, mit der hier die Exocytose einzelner Zellen quantitativ und zeitaufgelöst verfolgt wird. Mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen wird gleichzeitig die intrazelluläre Calciumkonzentration gemessen.
Den Calciumionen wurde lange Zeit eine zentrale Rolle in der Regulation der Exocytose zugeschrieben. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen aber, daß die bisherigen Modellvorstellungen zur Regulation der intrazellulären Calciumkonzentration und der Exocytose unzureichend sind.
Die hier ebenfalls untersuchten eosinophilen Granulocyten sind an verschiedenen Krankheiten, darunter Asthma, beteiligt. Mit den gezeigten Methoden ist es möglich, auch die Exocytose menschlicher Eosinophiler zu untersuchen. Dazu sind minimale Mengen an Spenderblut erforderlich, wodurch es in Zukunft möglich wird, diese Zellen während einer Erkrankung zu untersuchen.


Inhalt:

Abkürzungen
  1. Einführung
    1. Signalübertragung
    2. Exocytose
    3. Stimulation-Sekretions-Kopplung
    4. GTPasen
    5. Granulocyten
    6. Untersuchung der Exocytose an permeabilisierten Zellen
    7. Zielsetzung
  2. Methoden
    1. Zellpräparationen
      1. Neutrophile Granulocyten aus menschlichem Blut
      2. Eosinophile Granulocyten aus
        1. Meerschweinchen
        2. Pferdeblut
      3. Färbung nach Kimura
      4. Färbung mit Trypanblau
    2. Patch-clamp
      1. Kapazitätsmessungen
      2. Messungen der intrazellulären Calciumkonzentration
      3. Kalibrierung von Fura-2 Signalen
    3. GTP-bindende Proteine
      1. Zellfraktionierung
      2. Reaktionen mit Botulinum Toxin D und C3
      3. Photoaffinitätsmarkierung mit a 32P-GTP
      4. Proteinfällung mit Trichloressigsäure
      5. Gelelektrophorese
      6. Proteintransfer auf Nitrocellulose Western Blot
    4. overlay mit a 32P-GTP
    5. Proteinfärbung mit Ponceau S Rot
    6. Autoradiographie
    7. Densitometer
    8. Nachweis von b -Glucuronidase
    9. Statistik
    10. Geräte und Chemikalien
  3. Ergebnisse
    1. Kapazitätsmessungen an Neutrophilen
      1. GTPgS-induzierte Exocytose
      2. Zeitverlauf der Exocytose
    2. Calciummessungen in Neutrophilen
      1. GTPgS-induzierte Calciumtransienten
      2. Intrazelluläre Calciumfreisetzung
      3. Analyse der Calciumtransienten
      4. Externe Stimulation mit fMLP
      5. Calcium und Exocytose
    3. Calcium- und Kapazitätsmessungen an Eosinophilen
      1. GTPgS-induzierte Exocytose
      2. Bestimmung der Granulengröße
      3. Calciummessungen in Eosinophilen
      4. Menschliche Eosinophile
    4. GTP-bindende Proteine und Exocytose
      1. GTP-bindende Proteine in Neutrophilen
      2. Botulinum Toxine und Exocytose
      3. Patch-clamp Versuche mit isolierten GTP-bindenden Proteinen
      4. Versuche mit Botulinum Toxin
      5. Photoaffinitätsmarkierung von GTP-bindenden Proteinen
      6. GTP-bindende Proteine in Eosinophilen
  4. Diskussion
    1. Calcium und Exocytose in Granulocyten
      1. Mechanismen der Sekretion von Granulocyten
      2. Regulation des Calciums in aktivierten Granulocyten
    2. Regulation der Exocytose durch GTP-bindende Proteine
  5. Zusammenfassung
  6. Literatur
Danksagung
Leukocytenbilder




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