Biophysikalische Signalanalyse mit kontinuierlichen Relaxationsspektren

Holz, Martin


Die Zeitabhängigkeit physikalischer Größen wird bei Reaktionen 1. Ordnung üblicherweise mit E-Funktionen beschrieben. Für zahlreiche Prozesse in komplexen biologischen Makromolekülen ist dieses Verfahren jedoch weder plausibel, noch führt es zu reproduzierbaren Daten. Am Beispiel elektrischer und optischer Messungen am lichtenergiewandelnden Protein Bacteriorhodopsin entwickelt der Autor einen Gegenentwurf für die Datenanalyse auf der Basis der Theorie der Konformationssubzustände. Anstelle diskreter Ratenkonstanten werden nun transformierte kontinuierliche Relaxationsspektren an die Signale angepaßt. Versuche mit unterschiedlichen Funktionstypen für die spektrale Verteilungsdichte ergaben, daß dabei die Gauss-Glocke die besten Anpassungen liefert. Die für den Fit notwendigen FORTRAN-Routinen sind für interessierte Leser im Quellcode angegeben. Kontrollmessungen bei Variationen von Umgebungsparametern wie Temperatur, Ionenstärke, pH, Lichtenergie etc. ließen sich mit dem Modell der Gauss-verteilten Kinetik konsistenter auswerten, als mit diskreten E-Funktionen.
Den Abschluß bildet die Behandlung von gentechnischen Ausschaltexperimenten, bei denen durch "site directed mutagenesis" erstmals individuelle H+-Donatoren im Mechanismus der Protonenpumpe aufgrund spezifischer Veränderungen des Relaxationsspektrums identifiziert werden konnten.


Inhalt:

Verzeichnis mehrfach verwendeter Abkürzungen Teil A: Einführung in das Arbeitsgebiet und die Grundlagen der Meßmethode
  1. Einleitung: Problemstellung, Methoden und Zielsetzungen der Arbeit
  2. Struktur und Funktion der Protonenpumpe
    1. Der aktive Protonentransport
    2. Der Aufbau des Bacteriorhodopsinmoleküls
    3. Der Photoabsorptionszyklus von Bacteriorhodopsin
  3. Zeitauflösende elektrische Messungen an Bacteriorhodopsin
    1. Physikalische Grundlage des Meßverfahrens
      1. Ladungsverschiebungsmessung in Membranen
      2. Methoden zur Membranausrichtung und elektrischen Registrierung
    2. Material und Methoden
      1. Aufbau der Meßapparatur
      2. Präparation der photoaktiven Membranen
    3. Modell der mikroskopischen Verhältnisse an der Membran:
      1. Der Mechanismus der Anlagerung
      2. Charakterisierung der Komponenten des Meßsystems

      Teil B. Ergebnisse, die zur Charakterisierung der elektrischen Photoantwort unter Standardbedingungen führen

    4. Ersatzschaltbild und dessen Analyse
    5. Vergleich von Strom- und Spannungsmessungen
  4. Die Auswertung der Signalverläufe durch Funktionenanpassung
    1. Zeitgesetz als Summe von E-Funktionen
    2. Kontinuierliche Relaxationsspektren
      1. Relaxationsspektrum mit Glättungsrestriktion
      2. Die X2-Verteilung, Potenzgesetzsummen für U(t)
      3. Numerische Integration eines Spektrums aus Gauss-Verteilungen
    3. Spezielle Ursachen für das Vorliegen kontinuierlicher Relaxationsspektren in der Ladungsverschiebungskinetik von bR
  5. Analyse des Photozyklus mit verteilten Zeitkonstanten

      Teil C: Ergebnisse zur Analyse der Ursachen der einzelnen Komponenten des Photospannungssignals

  6. Veränderung der Photospannungskinetik bei gezielter Variation physikalischer Parameter
    1. Abhängigkeit der Photospannungskinetik von den Eigenschaften des Anregungslichts
    2. Versuche zur Hell-Dunkeladaptation
    3. Messung bei permanentem Hintergrundlicht
    4. Temperaturabhängigkeit der Kinetik der Photospannung
    5. Phasenzustand der Lipidmatrix und Aggregation des bR
  7. Untersuchungen zum Beitrag verschiedener Ladungsträger
    1. Effekte bei H2O - D2O Austausch
    2. Messungen in K+, Cs+, Ca2+, Mg2+ und La3+ bei verschiedenen Konzentrationen
    3. pH-Abhängigkeit der Kinetik der Ladungsbewegungen
    4. Einfluß der Pufferkapazität auf die Kinetik
  8. Messungen an bR mit chemisch modifiziertem Retinal
    1. Blockierung der Schiffschen Base durch deren Methylierung
    2. Abspaltung der Methylgruppe vom C13-Atom
  9. Untersuchungen an genetisch verändertem bR
    1. Aus Escherischia coli mit synthetischem Genom gewonnenes bR
    2. Übersicht über 60 Einzelsubstituionen
      1. Substitution von Tryptophan durch Phenylalanin
      2. Substitution von Tyrosin durch Phenylalanin und Alanin
      3. Substitution von Glutaminsäure (Glutamat) durch Glutamin
      4. Substitution von Prolin durch Alanin, Glycin oder Valin
      5. Substitution von Arginin durch Glutamin, Asparagin oder Aspartat
      6. Substitution von Aspartat durch Alanin, Asparagin oder Glutamat
    3. Aus transformierten Hefezellen gewonnenes bR
  10. Zusammenfassung
  11. Danksagung
  12. Literaturverzeichnis
    1. Verzeichnis der verwendeten Literatur
    2. Verzeichnis eigener Beiträge

  13. Anhang
    1. Ergebnisse photoelektrischer Messungen anderer Autoren
    2. Parameter der Systementladungsfunktion USys
    3. FORTRAN -Routinen zur Berechnung der Fitfunktionen
    4. Fitparameter aller Messungen an PM unter Standardbedingungen




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