Anwendung der Polymerase Kettenreaktion [PCR] als analytische und präparative Methode

bei Cytomegalovirus (CMV)-Untersuchungen an klinischem Untersuchungsmaterial

Ulrich Finckh


Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) erlebt seit ihrer Erstveröffentlichung (1985) einen regelrechten Siegeszug als analytisches Verfahren im Forschungslabor und in der medizinischen Diagnostik. Die vorliegende medizinische Promotionsarbeit enthält neue, auf PCR basierende Methoden und Daten zur klinischen Cytomegalovirus-Diagnostik und der nichtradioaktiven in situ Hybridisierung für die Lichtmikroskopie.
Im ersten Teil wird der Vorteil einer schnellen PCR-Diagnostik der Problematik einer nicht immer hinreichenden Spezifität der gewählten Methode gegenübergestellt. Im zweiten Teil wird die Anwendung der PCR als präparatives Verfahren zur Herstellung von Gensonden beschrieben. Die Sonden hatten eine unerwartet hohe Sensitivität, wobei dem hier beschriebenen, einfachen Verfahren Klonierungstechniken, Radioaktivität und aufwendige Fluoreszenzverfahren überflüssig waren.
Die Arbeit ist eine Bereicherung für den bislang in deutscher Sprache kaum repräsentierten Sektor der PCR-Literatur. Einige praktische und theoretische Aspekte der PCR werden komplett abgehandelt. Damit ist dieses Buch sowohl für experimentell, als auch für klinisch orientierte Anwender, ob "Insider" oder Einsteiger, unentbehrlich und von hohem Nutzen.

Arndt Rolfs


Inhalt:

Zusammenfassung
Einleitung

  1. Analytische Polymerase Kettenreaktion
    1. Problemstellung und Ziele
    2. Material und Methoden
      1. Vorgehen
      2. Untersuchte Patienten und Patientenproben
      3. Bearbeitung des Patientenmaterials
      4. Alkalische Lyse
      5. Herstellung und Berechnung von PCR-Positiv-Standards
      6. Verwendete Primer
      7. Optimierungsexperimente
      8. Zusammenstellung des PCR-Reaktionsansatzes
      9. Zeit- und Temperaturprofil der PCR
      10. Agarose Gel-Elektrophorese
      11. Photodokumentation
      12. Definition von PCR-Befunden im Agarose-Gel
    3. Resultate
      1. Befunde der PCR-Untersuchungen 1990
      2. Zwischenauswertungen der Untersuchungen 1990
        1. Schlußfolgerungen
      3. Befunde der PCR-Untersuchungen 1991
      4. Zusammenfassung der PCR-Resultate 1990/91
      5. PCR im Vergleich zur Virusanzucht
        1. Patient A01
        2. Patient A02
        3. Patient A03
        4. Patient A09
        5. Patient D46
      6. Bedeutung der PCR bei Patienten nach Leber- und Knochenmarkstransplantation
    4. Diskussion
    5. Zusammenfassung
  2. Präparative PCR
    1. Problemstellung und Ziele
    2. Material und Methoden
      1. Vorgehen
      2. PCR Nr. 1: Herstellung von template-DNA
        1. Protokoll PCR Nr. 1
        2. Verwendete Primer
        3. Temperatur- und Zeitprofil der PCR
      3. PCR Nr. 2: Reamplifikation und Markierung
        1. Protokoll PCR Nr. 2, dsDNA-Sonde
        2. Protokoll PCR Nr. 2, ssDNA-Sonde
        3. Hergestellte PCR-Sonden
        4. Reinigung der Sonden
        5. Abschätzung von Konzentration und Qualität
      4. in situ Hybridisierung
        1. Detektion von Virus-DNA in formalinfixiertem Gewebe
        2. Detektion Y-chromosomaler DNA in Lymphozyten
        3. in situ angewandte Sonden
    3. Resultate
      1. Sondensynthese
      2. in situ Hybridisierung (ISH)
        1. ISH mit Digoxigenin-11-dUTP-Sonden
        2. ISH mit Biotin-11-dUTP- und Biotin-21-dUTP-Sonden
    4. Diskussion
    5. Zusammenfassung
  3. Literaturverzeichnis
  4. Anhang
    1. Patientenbefunde 1990 aus PCR und Virusanzucht
    2. Patientenbefunde 1991 aus PCR und Virusanzucht
    3. Puffer und Lösungen
    4. Reagenzien und Chemikalien
    5. Abkürzungen und Begriffe
Schlußbemerkung und Danksagungen


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