Protonenbewegung und Oberflächenpotentialänderungen während des Photozyklus der membranständigen Protonenpumpe Bacteriorhodopsin

Eine Untersuchung mittels zeitaufgelöster Absorptionsspektroskopie und selektiv an der Proteinoberfläche gebundener pH-Indikatoren

Alexiev, Ulrike


Die lichtbetriebene Protonenpumpe Bacteriorhodopsin, die in bestimmten Bereichen der Plasmamembran (Purpurmembran) des Halobacterium salinarium vorkommt, steht im Mittelpunkt dieser Arbeit. Unter Absorption eines Lichtquants gibt das Protein Bacteriorhodopsin ein Proton auf der Zellaußenseite ab und nimmt danach ein Proton von der Zellinnenseite wieder auf. Die Autorin untersucht mittels einer Kombination von (bio-)physikalischen, biochemischen und molekularbiologischen Methoden die Funktionsweise dieses Proteins.
Ein Ziel dieser Arbeit war es, die Protonenabgabezeit an unterschiedlichen definierten Stellen an der Proteinoberfläche zu verfolgen. Dies erfolgte durch die kovalente Bindung von pH-Indikatoren an Bindungsstellen, die durch gerichtete Mutagenese in das Protein eingeführt wurden und zeitaufgelöster Absorptionsspektroskopie. Zum einen kann dadurch eine mögliche kinetische Korrelation mit den Prozessen im Protein während des Protonentransports durch die Membran detektiert werden. Zum anderen bieten die diversen Bindungsstellen an der extrazellulären und zytoplasmatischen Oberfläche die Möglichkeit, einen Transfer des Protons entlang der Protein- bzw. der Membranoberfläche zu verfolgen. Dieser Aspekt hat eine entscheidende Bedeutung für die Bioenergetik. Nach der chemiosmotischen Theorie von Mitchell entsteht der Protonengradient über der Membran zwischen den wässrigen Phasen, die sich beiderseits der Membran befinden. Es wird jedoch auch die Möglichkeit diskutiert, daß die Protonen direkt entlang der Membran wandern und so vom Ort ihrer "Entstehung" zum Ort ihres "Verbrauchs" gelangen können. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß sich das abgegebene Proton schneller entlang der Oberfläche der Bacteriorhodopsin-Mizellen bzw. der Purpurmembranen bewegt, als daß es in die äußere wässrige Phase abgegeben wird.
Die an der Proteinoberfläche gebundenen pH-Indikatoren konnten außerdem dazu benutzt werden, die Oberflächenladungsdichte und transiente Oberflächenladungsänderungen während des Protonenpumpvorgangs zu bestimmen.


Inhalt:

Abkürzungen
  1. Einleitung
    1. Zielstellung und Lösungsansatz
  2. Grundlagen
    1. Überblick über Struktur und Funktion der Protonenpumpe Bacteriorhodopsin
      1. Struktur
      2. Funktion
    2. Protonentransportmechanismen in biologischen Systemen
    3. Elektrostatik an biologischen Membranen
      1. Gouy-Chapman-Theorie
  3. Methoden und Materialien
    1. Absorptionsspektroskopie
    2. Zeitauflösende Absorptionsspektroskopie
    3. Optische pH-Indikatoren und zeitauflösende Absorptionsspektroskopie
      1. Messung der Protonenabgabe- und -aufnahmekinetik
      2. Bestimmung der Oberflächenladungsdichte
      3. Bestimmung der Polarität der Indikatorumgebung
    4. Auswertestrategien und Kurvenanpassung
      1. Photozyklus
      2. Transiente pH-Indikatorsignale
    5. Herstellung der bR-Mutanten mittels gezielter Mutagenese
    6. Bacteriorhodopsin-Präparationen
      1. Bacteriorhodopsin-Mizellen
      2. Purpurmembranen
    7. Chemische Modifizierungen der Cystein-Mutanten
      1. Reaktion der Cystein-Mutanten mit Fluorescein
      2. Papainverdau
  4. Ergebnisse und Diskussion Teil I: Modifizierung und spektroskopische Charakterisierung der bR-Mutanten
    1. Selektiver Einbau von Fluorescein in bR
    2. Spektroskopische Charakterisierung von Bacteriorhodopsin
      1. Wildtyp-Bacteriorhodopsin
      2. Cystein-Mutanten
      3. Modifizierte Cystein-Mutanten
    3. Zusammenfassung
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  5. Ergebnisse und Diskussion Teil II: Protonenkonzentrationsänderungen an der Proteinoberfläche und im Medium während des Photozyklus
    1. Analyse des Protonensignales
      1. G72C-AF im Mizellensystem
      2. G72C-MF im Patchsystem
    2. Simulation des Protonensignals
    3. Protonensignal im Mizellensystem
      1. Wildtyp
      2. Protonenkonzentrationsänderungen in Positionen auf der extrazellulären bR-Oberfläche
      3. Protonenkonzentrationsänderungen in Positionen auf der zytoplasmatischen bR-Oberfläche
      4. Abhängigkeit des Protonensignals von der Mizellenkomposition
      5. Temperaturabhängigkeit der Kinetik von Protonenabgabe und Aufbau des M-Intermediats
    4. Protonenkonzentrationsänderungen im Patchsystem
      1. Wildtyp
      2. Protonenkonzentrationsänderungen an der extrazellulären und zytoplasmatischen Purpurmembranoberfläche
      3. Temperaturabhängigkeit der Protonenabgabezeit
    5. Diskussion
  6. Ergebnisse und Diskussion Teil III: Oberflächenladungsdichte von Bacteriorhodopsin-Mizellen
    1. Charakterisierung der pH-Abhängigkeit des gebundenen Fluoresceins
    2. Salzabhängigkeit des pKs von ungebundenem und gebundenem Fluorescein
    3. Oberflächenladungsdichte auf der extrazellulären und zytoplasmatischen Proteinoberfläche
    4. Detergenzeffekt auf die Oberflächenladungsdichte
    5. Überprüfung der Anwendbarkeit der Gouy-Chapman-Theorie
    6. Beitrag des geladenen C-Terminus zur Oberflächenladungsdichte
    7. Anteil von ionisierbaren Aminosäuren im Innern des Proteins zur Oberflächenladungsdichte durch Chromophortitration
    8. Bestimmung der Oberflächenladungsdichte durch Chromophortitration
    9. Diskussion
  7. Ergebnisse und Diskussion Teil IV: Oberflächenpotentialänderungen während des Photozyklus
  8. Zusammenfassung
Literaturverzeichnis
Danksagung




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