Strukturuntersuchungen am Membranprotein Bacteriorhodopsin mittels Neutronenstreuung

Informationen über die Lage des Chromophors im Grundzustand und M-Intermediat durch spezifisch deuterierte Retinale

Hauß, Thomas


Ein wesentlicher Schritt zum Verständnis biologischer Systeme ist die Kenntnis der Struktur-Funktions-Beziehung von Proteinen. Dreidimensionale Strukturen wurden bisher fast ausschließlich von wasserlöslichen Proteinen gelöst. Der entscheidende Prozeß der Signaltransduktion (mit dem Spezialfall der Energiewandlung) findet aber an Membranen durch membrangebundene Proteine statt.
Der Autor zeigt hier Methoden auf, mit denen auch ohne 3D-Kristalle unter Ausnutzung spezieller Membraneigenschaften Strukturdaten gewonnen werden können. Dabei werden Daten über funktionell wichtige Teile des Proteins durch eine gezielte Markierung dieser Teile gewonnen. In der klassischen Röntgenkristallographie werden Schweratome als Marker eingesetzt (isomorpher Ersatz), wodurch allerdings die native Struktur chemisch verändert wird. Diesem Nachteil kann in der Neutronenstreuung begegnet werden, indem selektiv Protonen gegen Deuteronen ausgetauscht werden. Dieser Austausch verursacht keine chemische Änderung, wohl aber sind die Deuteronen aufgrund ihrer von Protonen sehr verschiedenen Streulänge in den Differenzdichten sichtbar.
Die vorliegenden Untersuchungen wurden an Bacteriorhodopsin durchgeführt, einem bakteriellen Membranprotein, das Lichtenergie in die elektrochemische Energie eines Protonengradienten wandelt. Eine zentrale Rolle dabei spielt der Chromophor Retinal, an dem u.a. die primäre Absorption des Lichtquants erfolgt. Das Ergebnis der Arbeit sind Strukturdaten, die die Lage dieser wichtigen Gruppe im Protein vor und nach der Lichtabsorption detailliert beschreiben.


Inhalt:

  1. Bacteriorhodopsin und Neutronenstreuung
    1. Bacteriorhodopsin, Photozyklus und Struktur
    2. Neutronenstreuung an Purpurmembranen
      1. Eindimensionale und zweidimensionale Gitter
      2. Der isomorphe Ersatz
      3. Das Diffraktometer
  2. Die Lokalisierung des Retinals auf der Membrannormalen
    1. Einleitung
    2. Probenpräparation
    3. Das Experiment
    4. Die Auswertung der lamellaren Streuexperimente
      1. Integration der Intensitäten
      2. Die Strategie zur Lösung des Phasenproblems
      3. Das H2O-D2O Austauschexperiment
      4. Die Phasen f w der Wasserstruktur
      5. Die Bestimmung der Lage D11- und der D5-Retinal Label
      6. Die Fehler der Labelpositionen
    5. Diskussion
      1. Die lamellare Struktur der PM-Stapel
      2. Die Retinallage auf der Membrannormalen
  3. Die Retinallage in BR568 und M412
    1. Einleitung
    2. Probenpräparation
    3. Einbau der Probe
    4. Die Diffraktionsexperimente
    5. Auswertung der Diffraktionsmessungen
      1. Integration der Reflexintensitäten
      2. Die Gittereigenschaften in BR568 und M412
      3. Berechnung der Fourier-Differenz
      4. Refinement
      5. Abschätzung der Fehlergrenzen des Refinements in den Koordinaten
    6. Diskussion
  4. Globale Strukturänderungen des Proteins zwischen BR568 und M412
Zusammenfassung
Literatur




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