Einfluß eukaryoter DNA-Methylierung auf Transkription und Latenz von HIV-1

Ein Beitrag zur Aufklärung der viralen Genregulation

Kai Schulze-Forster


Die HIV-1-Infektion ist nur unzureichend therapierbar und führt in fast allen Fällen zum Tod. Charakteristisch für die Infektion ist ein langes Latenzstadium, in dem die Virusvermehrung stark gehemmt ist und ein Infizierter sich gesund fühlt. Die Arbeit versucht, aus der Untersuchung der Genregulation in der Latenzphase einen neuen Therapieansatz zu entwickeln.
Die abschaltende Wirkung der DNA-Methylierung auf die regulatorische HIV-Geneinheit (LTR) wird in vitro gezeigt und anschließend das Auftreten dieser DNA-Modifikation in HIV-1-DNA aus Patienten untersucht. Es konnte DNA-Methylierung an wichtiger Stelle nachgewiesen werden. Aus den Daten leitet der Autor eine Modellvorstellung über die Beteiligung der DNA-Methylierung bei der HIV-1-Infektion ab. Eine Möglichkeit zur Verlängerung der Latenzphase auf der Basis der Ergebnisse wird diskutiert.
In einem Experimentalteil sind die Versuchsbedingungen ausführlich beschrieben. Methodische Weiterentwicklungen z.B. auf dem PCR-Gebiet und eine Einführung in die DNA-Methylierung machen dieses Buch für einen weiten Personenkreis interessant.


Inhalt:

  1. Einleitung
    1. Einführung in die DNA-Methylierung
    2. HIV-1 das dritte humane Retrovirus
    3. DNA-Methylierung ein Faktor in der viralen Replikationkontrolle?
    4. Zielsetzungen der Arbeit
  2. Experimenteller Teil
    1. Material
      1. Chemikalien und Reagenziensysteme
      2. Radioaktive Verbindungen/Szintillatoren
      3. Chromatographiemedien
      4. Enzyme und Proteine
      5. Nukleinsäuren
      6. Geräte und Verbrauchsmaterialien
      7. Puffer und Lösungen
    2. Methoden
      1. Standardtechniken
        1. Restriktionsverdau von DNA
        2. Ligation
        3. Phenolextraktion
        4. Alkoholfällung
        5. Dialysen
          1. G25-Minisäule
          2. Schlauchdialyse
          3. Plättchendialyse
        6. 5-Dephosphorilierung
        7. 5-Endmarkierung
        8. 3-Markierung durch Auffüllen von Restriktionsenden
        9. nick-Translation
        10. Alkali Southern blot
        11. DNA-DNA-Hybridisierung
        12. ECL-Detektion
        13. Agarose-Gelelektrophorese
        14. Polyacrylamid-Gelelektrophorese
      2. DNA-Methylierung
        1. Eukaryote DNA-Methylierung
        2. Hpa II-Methylierung
        3. Sss I-Methylierung
      3. Modifizierung des LTR in pHIV1-LTR-CAT
      4. Isolierung der eukaryoten DNA-Methyltransferase
        1. Reinigung aus Rattenleber
        2. Charakterisierung der Methyltransferase-Präparation
          1. Test auf kontaminierende Endonukleasen
          2. Test auf kontaminierende Exonukleasen
          3. Test auf vollständige Methylierung
      5. DNA-Isolierung
        1. Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli
        2. Plasmid-Schnellpräparation aus Bakterien
        3. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
        4. Isolierung extrachromosomaler DNA
        5. Isolierung humaner Lymphozyten-DNA für die PCR
      6. Quantifizierungen
        1. Spektralphotometrische DNA-Bestimmung
        2. Elektrophoretische DNA-Bestimmung
        3. Proteinbestimmung nach Bradford
      7. Deletion der Ava I-Stelle im pBR322-Anteil von pHIV1-LTR-CAT
      8. Transformation von E. coli
      9. Kultivierung eukaryoter Zellen
      10. Transfektion
      11. CAT assay
        1. HPLC-Detektion
        2. DC-Detektion
      12. Test auf Demethylierung
      13. PCR
        1. PCR-Reaktion
        2. Konstuktion interner, homologer PCR-Standards
        3. Restriktion vor PCR
      14. DNA/Protein-Bindungsstudien
        1. Proteinextraktion
        2. Proteinfraktionierung an Heparin-Agarose
        3. Mobility Shift Assay
        4. PCR-Methode zur Markierung nur eines DNA-Strangs
        5. DNase I Footprinting
      15. DNA-Sequenzierung nach Maxam/Gilbert
  3. Ergebnisse
    1. Isolierung der eukaryoten DNA-Methyltransferase
      1. Test auf kontaminierende Endonukleasen
      2. Test auf kontaminierende Exonukleasen
      3. Test auf vollständige Methylierung
    2. Verteilung der Hauptmethylierungssequenz CG in HIV-1
    3. Einfluß von DNA-Methylierung auf das LTR von HIV-1
      1. Etablierung eines nichtradioaktiven CAT assays
      2. Eukaryote Methylierung des LTR
        1. Methylierung des gesamten LTR
        2. Methylierung von LTR-Teilbereichen
      3. Methylierung des LTR mit Hpa II-Methyltransferase
      4. Test auf Demethylierung
    4. Untersuchung des Methylierungsstatus in HIV-1 infizierten Patienten
      1. Entwicklung einer restriktionsabhängigen PCR
      2. Entwicklung einer auf PCR basierenden Methode zum Erhalt interner, homologer PCR-Standards
      3. Nichtradioaktive Detektion von PCR-Produkten
      4. Untersuchung von proviraler HIV1-DNA aus latent infizierten Patienten auf Methylierung
      5. Untersuchung von proviraler HIV1-DNA aus Patienten mit AIDS auf Methylierung
      6. Quantitative Bestimmung des Anteils methylierter HIV1-DNA
    5. Veränderung von HIV1-DNA/Protein-Interaktion durch DNA-Methylierung
      1. Mobility Shift Assay
      2. DNase I Footprinting
        1. Erhalt von DNA-Fragmenten zum Footprinting durch PCR
        2. DNase I Footprinting des KP1/KP2-Fragments
        3. DNase I Footprinting des Msp I/Hind III-Fragments
  4. Diskussion
    1. Isolierung der eukaryoten DNA-Methyltransferase
    2. CAT assay
    3. In vitro-Methylierung des HIV1-LTR
    4. Einfluß von tat auf die Methylierungs-Inhibition
    5. Untersuchung des Methylierungsstatus in vivo
    6. Auswirkungen der LTR-Methylierung auf die Protein-Bindung
    7. Modell zum Einfluß der DNA-Methylierung bei der HIV1-Infektion
    8. Ausblick
  5. Zusammenfassung der Ergebnisse
  6. Anhang
    1. Verzeichnis der Zeichen und Abkürzungen
    2. Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
    3. Literaturverzeichnis



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